EFECTO DEL METODO DE INOCULACIÓN Y LA PRESENCIA DE HERIDAS EN LA RAIZ SOBRE EL MARCHITAMIENTO VASCULAR DE PLANTAS DE UCHUVA (Physalis peruviana L.) CAUSADO POR Fusarium oxysporum Andrés Nicolás Rodríguez Romero anrodriguez@unal.edu.co, Luz Adriana Pedraza Herrera lapedrazah@unal.edu.co Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia, Bogotá RESUMEN Fusarium oxysporum causa marchitamiento vascular en la uchuva, una importante enfermedad que ocasiona perdidas totales en el cultivo y esta presente en Colombia. La búsqueda y evaluación de estrategias de manejo de la enfermedad han requerido el desarrollo de métodos de inoculación que coincidan con el proceso de infección natural del patógeno. Este trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto del método de inoculación sobre el desarrollo de del marchitamiento vascular en plantas de uchuva. Para lo cual, se evaluó el método de inoculación del suelo y de inmersión de plantas dentro del inoculo de F. oxysporum con presencia o no de heridas en la raíz. Asi, los resultados mostraron que el método de inoculación tiene un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad, siendo mayor para la inoculación por inmersión en términos de severidad, incidencia, AUDPC, tiempo de incubación y grado de decoloración. La presencia de heridas no mostro efecto sobre estas variables. Adicionalmente, se encontró que variables como longitud y peso de la planta, contenido de clorofilas y defoliación se ven afectadas por la presencia del patógeno. PALABRAS CLAVE: F. oxysporum, P. peruviana, método de inoculación, marchitamiento vascular ABSTRACT Fusarium oxysporum causes vascular wilt in cape gooseberry, an important disease that causes total losses in the crop and is present in Colombia. The search and evaluation of disease management strategies have required the development of inoculation methods that coincide with the process of natural infection of the pathogen. The objective of this work was to determine the effect of the inoculation method on the development of vascular wilt in cape gooseberry plants. For which, the method of inoculation of the soil and of immersion of plants inside the inoculum of F. oxysporum with presence or not of wounds in the root was evaluated. Thus, the results showed that the method of inoculation has an effect on the development of the disease, being higher for inoculation by immersion in terms of severity, incidence, AUDPC, incubation time and degree of discoloration. The presence of wounds showed no effect on these variables. Additionally, it was found that variables such as length and weight of the plant, chlorophyll content and defoliation are affected by the presence of the pathogen. WORLD KEY: F. oxysporum, P. peruviana, method of inoculation, vascular wilt 1 INTRODUCCIÓN La Uchuva (Physalis peruviana L. Solanaceae) es una planta distribuida en zonas altas de Suramérica y originaria del Perú (Popenoe et al., 1990). Tiene un alto valor nutricional del fruto y propiedades medicinales (Gastelum, 2012; Pinto et al., 2009). Colombia es el mayor productor mundial reportando para el 2011 (Rodríguez – Amézquita et al., 2010). En los últimos años se ha implementado el desarrollo tecnológico del cultivo en el país, con trabajos dirigidos a la optimización y al manejo integral de las enfermedades (Fischer et al., 2014). Para Colombia se identifican tres enfermedades siendo el marchitamiento vascular causada por Fusarium oxysporum la de mayor importancia en el país con pérdidas totales del cultivo (Bernal et al., 2013). Su manejo es dificil dada la resistencia del hongo a fungicidas y a su capacidad de sobrevivir durante largos periodos de tiempo en el suelo por la producción de clamidosporas (McGoven, 2015). De esta manera, la aplicación de fungicidas y rotación de cultivos no han resultado efectivos (Osorio-Guarín et al., 2016). Otras alternativas apuestan a la búsqueda y desarrollo de cultivares resistentes o al control biológico (Moreno et al., 2014; Enciso-Rodríguez et al., 2013). En todos los casos el desarrollo de un apropiado modelo de infección del patógeno en la planta, permitiría evaluar diferentes estrategias de manejo en búsqueda a una solución a la problemática (Maitlo et al., 2016). En este contexto, diversos autores reportan el efecto del método de inoculación sobre el desarrollo de la enfermedad causada por F. oxysporum dentro de diferentes patosistemas (Maitlo et al., 2016; Yadav et al., 2017). Se debe tener en cuenta para la optimización de un método de inoculación, que este debe aproximarse a la realidad del patosistema y en este caso, el micelio de F. oxysporum penetra a través de la raíz de manera directa o a través de heridas (Fischer y Miranda, 2012). De manera adicional, se ha encontrado a través de qPCR que la concentración de F. oxysporum en el suelo oscila entre 104 y 106 microconidias. g-1 (Jiménez-Fernández et al., 2010), lo que sugiere que, para el estudio de la enfermedad causado por este patógeno, se pueden usar concentraciones dentro de este rango. En la actualidad no está documentado cual es el método de inoculación más efectiva en el desarrollo de la enfermedad en el patosistema uchuva – F. oxysporum, sin embargo, varios trabajos describen el uso de métodos asociados a inoculación de suelo y a inmersión de la raíz de la planta en la suspensión del patógeno (Moreno et al., 2014; Estupiñán y Ossa, 2007). Adicionalmente, no se conoce el efecto de la presencia de heridas sobre la raíz en relación al desarrollo de la enfermedad. Así, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del método de inoculación y la presencia de heridas en la raíz sobre el desarrollo del marchitamiento vascular de la uchuva causado por Fusarium oxysporum con el fin de determinar cuál es el más efectivo para futuras aplicaciones en diferentes estudios. 2 METODOLOGIA 1. Material vegetal: Plantas de Uchuva (Physalis peruviana) del ecotipo Colombia de 2 meses de crecidas fueron proveídas del Centro de Bio-sistemas de la Universidad Jorge Tadeo Lozano con certificación de ausencia total del patógeno. 2. Aislamiento, multiplicación del patógeno e inoculación: La cepa F. oxysporum Map5 considerada como altamente virulenta (Enciso-Rodríguez et al., 2013) fue aislada desde plantas de uchuva infectadas previamente y proveídas por el Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia. Para ello, se usó la metodología propuesta por Ortiz et al., (2011) y los explantes fueron sembrados sobre agar papa dextrosa (PDA) e incubados 25°C durante ocho días. Posteriormente, se seleccionó colonias con morfología macroscópica típica a los reportado para F. oxysporum, como algodonoso de color blanco con producción de pigmentos. A este tipo de colonias se les realizó micro preparaciones y observaciones con microscopio óptico (40X) posterior a tinción con azul de lactofenol. En estas observaciones se identificó la morfología típica para F. oxysporum como microconidias unicelulares (5-12 x 2.5-3.5 micras), septada, hialinas de forma variable sobre fiálides laterales y conidióforos poco ramificados (Nelson, 1981); así como la presencia de macroconidias fusiformes, largas y en forma de hoz, con tres a cinco septos transversales (Nelson, 1981). También se buscaron clamidosporas globosas, de doble pared gruesa, solitarias o en pares. Colonias que correspondieron las características de F. oxysporum fueron purificados por repique usando asa recta a nuevos medios PDA. Para la preparación del inoculo, inicialmente se evaluaron los medios de cultivo Czapeck, extracto de malta, caldo papa-dextrosa y caldo Saburoud. Para ello, elenmeyer de 125 mL conteniendo 15 mL de medio de cultivo fueron inoculados con una porción de 0,25 cm de diámetro extraída de manera homogénea con un sacabocados. Los medios fueron incubados durante 8 días a 25°C y 125 rpm. Transcurrido los ocho días se determinó la concentración obtenida en términos de microconidias. mL-1 de medio de cultivo usando conteo por cámara de Neubauer. El medio que mostro la mejor concentración fue usado para la fase posterior. Tres elenmeyer de 1000 mL conteniendo 150 mL de medio liquido Czapeck fueron inoculados con el hongo e incubados en agitador orbital durante 8 días a 25°C y 125 rpm. El con tenido de los elenmeyer fue pasado a tubos de centrifuga de 50 mL y centrifugados a 8000 rpm durante 5 minutos para la obtención de la biomasa. Posteriormente, se hicieron tres lavados con agua destilada estéril y se suspendió la biomasa de cada elenmeyer en 150 mL de agua destilada estéril. Esta suspensión obtenida fue filtrada usando un embudo de vidrio conteniendo gasa estéril. La concentración de microconidias del hongo fue determinada usando cámara de Neubauer y se ajustó el inoculo con agua una concentración de 1x106 UFC.mL-1 (EncisoRodríguez et al., 2013; Moreno et al., 2014; Estupiñán y Ossa, 2007). Como sustrato soporte de las plantas se usó suelo de la Sabana de Bogotá, el cual fue proveído por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia quienes garantizaron la ausencia del patógeno en el mismo. Las plantas fueron dejadas bajo condiciones de 3 invernadero (15°C; 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad) y se realizara riego con a gua cada tercer día. Para evitar las eficiencias nutricionales se usó el fertilizante XXX Para la inoculación de las plantas se usaron dos métodos de inoculación los cuales llevaron heridas o no como se describe a continuación: a. Inoculación del suelo: Un volumen de 100 mL de la suspensión de microconidias preparada anteriormente fue aplicado por cada 900 g de suelo de acuerdo a la metodología propuesta por Moreno et al., (2014). Las plantas fueron sembradas en bolsas negras con 500 g de suelo inoculado. Como tratamiento control se usaron plantas sembradas en suelo no inoculado con el patógeno. b. Inoculación del suelo con corte de plantas: Un volumen de 100 mL de la suspensión de microconidias preparada anteriormente fue aplicado por cada 900 g de suelo de acuerdo a la metodología propuesta por Moreno et al., (2014). A las plantas se les corto 1cm del ápice de la raíz con tijeras estériles de acuerdo con la metodología propuesta por Estupiñán y Ossa, (2007) y posteriormente se colocaron en bolsas con 500 g del suelo previamente inoculado con el patógeno. Como tratamiento control se usarán plantas sembradas en suelo no inoculado y a las cuales se les había realizado el corte en la raíz. c. Inmersión: Las raíces de las plantas de uchuva fueron sumergidas en 50 mL del inoculo preparado previamente durante 15 minutos de acuerdo con la metodología propuesta por Wellmann, (1939), posteriormente se sembraron en bolsas con 500 g de suelo. Como tratamiento control las plantas fueron sumergidas en agua destilada estéril sin presencia del patógeno d. Inmersión con corte: se cortó1cm del ápice de la raíz de las plantas con tijeras estériles de acuerdo con la metodología propuesta por Estupiñán y Ossa, (2007), posteriormente las plantas fueron sumergidas en 50 mL del inoculo durante 15 minutos, posteriormente se sembraron en bolsas con 500 g de suelo. Como tratamiento control las plantas fueron sumergidas en agua destilada estéril sin presencia del patógeno y las cuales habían sido cortadas. 3. Evaluación del desarrollo de la enfermedad: El desarrollo de la enfermedad fue evaluado realizando observaciones diarias hasta obtener la aparición de síntomas de enfermedad de acuerdo con la escala de severidad descrita por Enciso-Rodríguez et al., (2013) y que se encuentra en el anexo 1. Se realizo la curva de progreso de enfermedad teniendo en cuenta la variable severidad en el tiempo para ello se usará la escala descrita previamente sobre todas las plantas de cada tratamiento. Las observaciones se hicieron cada tercer día y posteriormente se calculó el área bajo la curva (AUDPC) de acuerdo con la fórmula propuesta por Shanner y Finner et al., (1977) para cada uno de los tratamientos. El índice de severidad se calculó de acuerdo a la fórmula propuesta por Enciso-Rodríguez et al., (2013). También se determinó la incidencia de la enfermedad para cada uno de los tratamientos, en este caso el porcentaje de incidencia fue calculado con el número de casos dividido por el tamaño de la población en el periodo de incubación de acuerdo con Osorio-Guarín et al., (2016). 4 De otra parte, se hizo el reaislamiento del patógeno en las plantas inoculadas, para lo cual, las plantas fueron retiradas desde el sustrato, lavadas y posteriormente se tomaron explantes desde el cuello del tallo. A los explantes se les realizó una desinfección superficial de acuerdo lo propuesto por Ortiz et al., 2011) y fueron colocados sobre agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron las cajas a 25°C durante ocho días. Así, se determino la frecuencia de aislamiento por cada 5 explantes en cada uno de los tratamientos. Así mismo, se determinó las unidades formadoras de colonia del patógeno por gramo de planta (UFC F. oxysporum. g-1 de peso fresco de planta) en cada uno de los tratamientos. Para ello, se realizaron dos evaluaciones en el tiempo, una a los 21 días y otra a los 36 días después de la inoculación de las plantas De esta manera, plantas de estas dos etapas y de cada uno de los tratamientos fueron retiradas del sustrato, lavadas y se les quito la raíz, se tomó un fragmento de 2 cm dentro de esta misma zona el cual se cortó en fragmentos más pequeños. Se pesaron los fragmentos y se desinfectaron superficialmente con el protocolo descrito anteriormente. Los fragmentos pesados y desinfectados fueron llevados a un tubo eppendorf estéril con 1 mL de agua y se dejaron en agitación durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente la suspensión obtenida fue usada para realizar diluciones seriadas y las mismas fueron sembradas en PDA incubando a 25°C durante 8 días. Posteriormente se realizaro el conteo del número de colonias correspondientes a la morfología descrita anteriormente para determinar UFC.g -1 de tallo. Dentro de la evaluación del desarrollo de la enfermedad también se determinó la decoloración vascular a los 36 días después de inoculación, así, plantas de cada uno de los tratamientos fueron retiradas del sustrato, lavadas y seccionadas transversalmente. Para medir la decoloración vascular, se siguió la escala de color propuesta por CIAT, (1987) (Figura 1). Figura 1. Escala de decoloración vascular. Tomado de Estupiñán y Ossa (2007). 4. Determinación del periodo de incubación: Para la determinación de este periodo de enfermedad, una vez se realizó la inoculación se hicieron observaciones diarias hasta observar la aparición de los primeros síntomas de enfermedad de acuerdo con la escala de severidad mencionada anteriormente. Esta determinación se hizo para todos los tratamientos. 5. Evaluación del efecto de tratamientos sobe el hospedante: Se evaluaron las variables, longitud de vástago y raíz y peso seco de vástago y raíz, además de la relación vástago/raíz. Las variables fisiológicas evaluadas fueron contenido relativo de agua 5 de acuerdo a la metodología propuesta por Barrs y Weatherley (1962) y el contenido de clorofilas con ayuda de clorofilometro (SPAD-502), con el cual se tomarán 10 mediciones paralelas a la vena central del haz de la hoja, cinco a cada lado, y se promediarán los calores de acuerdo con lo propuesto por Novoa y Villagrán (2002). Adicionalmente, se conto el numero de hojas por planta para cada tratamiento para conocer si había algún efecto de la inoculación del patógeno sobre la defoliación de la planta. 6. Diseño experimental y análisis de datos: El diseño experimental consistió en un diseño completamente aleatorizado donde los tratamientos constaron de la combinatoria de método de inoculación y presencia de herida o no en la raíz, donde además se incluyó pantas inoculados y controles no inoculados para un total de 8 tratamientos. Todos los tratamientos contaron con 3 réplicas donde cada unidad experimental constó de 3 plantas, para un total de 72 plantas. De esta manera, los tratamientos se rotularon como sigue: - CM1: Control no inoculado método de inoculación en suelo sin herida - CM2: Control no inoculado método de inoculación en suelo con herida - CM3: Control no inoculado método de inoculación por inmersión sin herida - CM4: Control no inoculado método de inoculación por inmersión con herida - FM1: Plantas inoculadas con F. oxysporum método de inoculación en suelo sin herida - FM2: Plantas inoculadas con F. oxysporum método de inoculación en suelo con herida - FM3: Plantas inoculadas con F. oxysporum método de inoculación por inmersión sin herida - FM4: Plantas inoculadas con F. oxysporum método de inoculación por inmersión con herida Para la evaluación de UFC de F. oxysporum. g-1 de planta se usó un set de plantas aparte el cual fue destructivo con dos determinaciones en el tiempo. En este caso el diseño de experimentos será el mismo propuesto anteriormente, pero los tratamientos contaron con 3 réplicas donde cada unidad experimental fue de 1 planta para un total de 48 plantas. Para el análisis de los datos se realizó pruebas de normalidad, homogeneidad y homocedasticidad de datos, análisis de varianza y pruebas de comparaciones múltiples usando el software R versión 3.32. RESULTADOS F. oxysporum pudo ser aislado desde plantas inoculadas y mostro mayor producción de conidias en medio Czapeck El aislamiento de F. oxysporum fue obtenido desde explantes de las plantas inoculadas previamente, la morfología correspondió a lo esperado, colonias algodonosas con pigmentación violeta. Observaciones microscópicas mostraron presencia de microconidias en falsas cabezas y clamidosporas globosas intercalares y terminales (Anexo 2). 6 Al usar los diferentes medios de cultivo, se seleccionó el medio Czapeck dado que muestra la mayor producción de macroconidias a los 8 días de incubación (datos no mostrados). El método de inoculación tiene un efecto sobre el desarrollo de marchitamiento vascular de F. oxysporum en uchuva El índice de severidad de la enfermedad separo los tratamientos que implicaron inoculación en suelo (FM1 y FM2) de aquellos que se hicieron por inmersión (FM3 y FM4), de tal manera que la severidad fue mayor en todos los tiempos de evaluación y con diferencias significativas para el método de inmersión. En tanto, el factor de causar heridas sobre la raíz no mostro ningún efecto adicional al obtenido con el método de inoculación (figura 2, C). Figura 2. Efecto del método de inoculación sobre el desarrollo de la enfermedad. (A) Porcentaje de incidencia de la enfermedad; (B) Área bajo la curva de la enfermedad (AUDPC); (C) Índice de severidad en el tiempo. * Letras diferentes muestran diferencias estadísticas usando Test de Kruskal Wallis con una significancia del 95% en A y C; y usando test de Duncan con el 95% de significancia en B. Las comparaciones en C están realizadas entre tratamientos para cada uno de los tiempos de determinación. El área bajo la curva de la enfermedad AUDPC permitió corroborar el efecto del método de inoculación sobre el desarrollo de la enfermedad, siendo mayor para los tratamientos donde la inoculación se hizo por inmersión de las raíces de las plantas en relación a los inoculados en el suelo. Nuevamente, se evidencio que el hecho de causar heridas no muestra ningún efecto adicional al método de inoculación (figura 2, B). La incidencia se realizó a partir de la aparición de los primeros síntomas de enfermedad mostrando que hay diferencias significativas entre los tratamientos del método de inoculación, obteniendo un mayor porcentaje de incidencia para plantas inoculadas con el método de inmersión y sin efectos por la presencia de heridas (figura 2, A). Ninguno de los tratamientos no inoculados o control mostro síntomas de enfermedad como se evidencia en la figura 2 (A, B y C). 7 La metodología usada para la determinación de la concentración de F. oxysporum en las plantas no fue efectiva, en términos que no se logró crecimiento de colonias del hongo en medio PDA a partir de diluciones a pesar de haber obtenido el crecimiento del patógeno desde los explantes. Este desacierto impidió la determinación de esta variable que tendría bastante importancia para los resultados obtenidos. El periodo de incubación fue de 18 días para los tratamientos con inoculación por inmersión y de 21 días para las inoculaciones en el suelo. No hubo diferencias para plantas con o sin heridas. F. oxysporum está presente en mayor proporción en plantas inoculadas por inmersión F. oxysporum pudo ser reaislado desde plantas con síntomas de enfermedad siendo más frecuente en tratamientos inoculados por inmersión para el primer tiempo de evaluación en relación a tratamientos con inoculaciones en suelo, además se destaca que cuando hubo heridas se pudo obtener una mayor frecuencia de aislamiento del patógeno con diferencias estadísticas a los tratamientos sin heridas. Para el segundo tiempo de evaluación la frecuencia de aislamiento se estabiliza siendo igual para todos los tratamientos inoculados (Figura 3, A). El patógeno no fue detectado en tratamientos correspondientes a controles no inoculados pudiendo ser asociado a la sintomatología encontrada. En el mismo sentido, la evaluación de la decoloración en el sistema vascular mostro ser mayor para el método de inoculación sin haber efecto de la presencia de heridas (figura 3, B) Figura 3. Presencia de F. oxysporum en plantas de uchuva. (A) Frecuencia de aislamiento de F. oxysporum en plantas; (B) Grado de decoloración corte longitudinal de tallo de plantas * Letras diferentes muestran diferencias estadísticas usando Test de Kruskal Wallis con una significancia del 95%. F. oxysporum tiene un efecto sobre variables agronómicas y fisiológicas de plantas de uchuva Se encontró para los tratamientos FM2, FM3 y FM4 una importante disminución de las variables longitud de vástago y raíz en relaciones a los controles no inoculados. El tratamiento FM1 no se vio afectado para estas variables (figura 4, A). Este mismo comportamiento fue observado para las variables peso seco de vástago y raíz, donde nuevamente se ve afectado FM2, FM3 y FM4, pero no FM1 (figura 4, C). Por su parte, la relación vástago/raíz no fue informativa en esta 8 evaluación, mostrando similar para todos los tratamientos y por debajo de 0,5 indicando que de manera general la longitud fue mayor al vástago en las plantas (figura 4, B). En relación al numero de hojas por planta indico que hubo un efecto del método de inoculación, siendo mayor la defoliación en plantas de tratamientos que implicaron una inoculación del patógeno por inmersión en relación a las inoculaciones en suelo con diferencias estadísticas. Los controles tuvieron un mayor numero de hojas por planta en la fase de evaluación final sin mostrar diferencias entre los mismos (figura 4, D). Figura. Efecto de F. oxysporum sobre variables agronómicas y fisiológicas de plantas de uchuva. (A) Longitud de vástago y raíz; (B) Relación vástago/raíz; (C) Peso seco vástago y raíz; (D) Numero de hojas por planta; (E) Contenido de clorofilas totales; (F) Contenido relativo de agua * Letras diferentes muestran diferencias estadísticas usando Duncan con una significancia del 95%. Este mismo comportamiento fue encontrado para la variable contenido de clorofilas, el cual se vio reducido para tratamientos inoculados con F. oxysporum en relación a plantas no inoculadas con el patógeno y adicionalmente, se observó un efecto importante de método de inoculación 9 siendo mayor la reducción en plantas inoculadas por inmersión en relación a plantas inoculadas en suelo (figura 4, E). Finalmente, la variable contenida de agua mostro ser una variable poco informativa para el efecto de F. oxysporum sobre la planta, ya que no hay se mostro alguna tendencia en particular entre los tratamientos, por el contrario, se fueron homogéneos a excepción de uno de los controles (figura 4, F). DISCUSION El aislamiento obtenido desde las plantas proporcionados mostro las características típicas de F. oxysporum de acuerdo a los descrito previamente y reportado por Nelson, (1981). Así mismo, el mejor medio para el crecimiento del patógeno fue el medio Czapeck lo cual es coherente con lo reportado por Khilare y Ahmed (2012) para una cepa de F. oxysporum fsp ciceri. Los síntomas de enfermedad observados son los mismos descritos por Enciso-Rodríguez et al., (2013) y se pudo reaislar el patógeno inoculado lo cual garantizo que dicha sintomatología si fuera causada por el mismo, siendo totalmente corroborado por la ausencia del patógeno y los síntomas en plantas no inoculadas. El desarrollo de la enfermedad se vio afectada por el método de inoculación mostrando valores mayores de incidencia, severidad, AUDPC y un menor tiempo de incubación para tratamientos donde se inocularon las plantas por inmersión (FM3, FM4). Efectos del método de inoculación sobre el desarrollo de enfermedad por F. oxysporum ya había sido previamente encontrados por Maitlo et al., (2016) dentro del patosistema garbanzo - F. oxysporum fsp ciceri y por Purwati et al., (2008) en la interacción F. oxysporum fsp cubense en banano. Sin embargo, este ultimo autor reporta las heridas como un factor importante en el desarrollo de la enfermedad dentro del método de inmersión de la raíz vegetal lo cual es contrastante a lo encontrado en el presente estudio. Por su parte, el efecto de F. oxysporum sobre las variables longitud y peso de vástago y raíz ya había sido previamente reportado por Guler and Guldur., (2018) en plántulas de pimienta, se presume esto se deba a que el daño ocasionado en el sistema vascular impide el paso de agua y nutrientes a las diferentes partes de la planta. En el presente estudio se mostró un fuerte efecto de la presencia del patógeno sobre el contenido de las clorofilas y defoliación de plantas, el cual estuvo más marcado cuando se usó inoculación por inmersión (FM3 y FM4). Efecto de Fusarium sobre la clorofila y la senescencia de la planta había sido descrito por Dong et al., (2014) en hojas de banana inoculadas con F. oxysporum f.sp cubense, donde se propone que existe una correlación entre la sintomatología en la planta y la disminución de la eficiencia fotosintética y esto puede deberse a la producción de acido fusarico que claramente contribuye al proceso de senescencia foliar. CONCLUSIONES El método de inoculación tiene efecto sobre el desarrollo del marchitamiento vascular en plantas de uchuva, siendo la inoculación por inmersión de la raíz de la planta mas efectivo y con mayor efecto sobre incidencia, severidad, AUDPC, grado de decoloración y variables agronómicas y fisiológicas como longitud y peso de vástago y raíz, defoliación de la planta y contenido de 10 clorofilas. La presencia de heridas sobre la planta no afecta el desarrollo de la enfermedad ni le suma al efecto del método de inoculación. ANEXO 1. ESCALA DE SEVERIDAD (Enciso-Rodríguez et al., 2013) Table S1: Severity scale of symptoms for the Physalis peruviana - Fusarium oxysyporum pathosystem. Category Name Degree Severity(%) Main Symptoms 0 =0 Any visible symptoms 1 ≤5 Few leaf damage, low to moderate discoloration ≥ 6 - ≤10 Few lesions on the leaves; discoloration to light green with many dark green areas Phenotype 0. Resistance 2 1. Low susceptible 3 2. Moderately susceptible 4 ≥11-≤ 20 ≥21-≤ 40 Few lesions, wilting on the edge of the leaf; shortly infected leaves, pale green or slightly yellow, with loss of turgor. Evident infection in the leaves, discoloration to pale yellow, dried leaf edges, brown 11 "burned", with little or no turgor, moderate infection of the stem; chlorosis. ≥41-≤ 60 Severe infection of leaves, yellow ocher shades, dried leaf to the midrib, "burned" edges; prostration of pedicel; total loss of turgor, moderate infection on the stem and purple color on the basis of the stem, chlorosis and / or necrosis. ≥61-≤ 70 Severe lesions on the leaves, "Burn" overall, wilting, chlorosis, necrosis and / or premature defoliation; prostration of the stem, purple stain on the basis of the stem. 7 ≥71-≤ 80 Dead leaves or 100% wilting, chlorosis, necrosis and / or premature defoliation, severe prostration, purple or violet stain on the stem. 8 ≥81 -≤ 90 5 6 3. Susceptible 4. Highly susceptible Dead leaves, wilting, chlorosis, necrosis and severe 12 defoliation, stem without force. 9 ≥91 -≤ 100 Dead plant 13 REFERENCIAS Agronet. (2013). Disponible en http:www.agronet.gov.co/. Consultado en febrero de 2018. Barrs H and Weatherley P. (1962). A re examination of the relative turgidity technique for stimating wáter deficits in leaves. Australian Journal og Biological Science. 15: 413-428. Bernal A, Cotes A, Rodríguez A, López C et al., (2013). Generación de valor para el desarrollo competitivo del cultivo de la uchuva como modelo de bioprospección de frutas en Colombia. In: Cotes A, Barrero S, Zuluaga M y Arévalo H. Bioprospección para el desarrollo del sector agropecuario de Colombia. Bogotá D.C. Produmedios. CIAT. (1987). Standard system for the evaluation of vean germless. CIAT. Cali, Colombia. Pp: 20. Dong X, Xiong Y, Ling N, Shen Q and Guo S. (2014). Fusaric acid accelerates the senescence of leaf in banana when infected by Fusarium. World J Microbiol Biotechnol. 30: 1399-1408. Enciso-Rodríguez FE, González C, Rodríguez EA, López CE, Landsman D, Barrero LS, MariñoRamírez L. (2013). Identification of immunity related genes to study the Physalis peruvianaFusarium oxysporum pathosystem. PLoS One. 2013;8:e68500 Estupiñán H y Ossa J. (2007). Efecto del agente causal del marchitamiento vascular de la uchuva (Physalis peruviana L.) el hongo Fusarium oxysporum Shelchet. sobre algunas solanáceas y otras especies cultivadas afectadas por formas especiales del microorganismo. Tesis de Grado. Universidad Javeriana. Bogotá – Colombia. Fischer G, Almanza – Merchán P y Miranda D. (2014). Importancia y cultivo de la uchuva (Physalis peruviana L.). Revista Brasilera de Fruticultura. Vol.36 (1). DOI. 10.1590/0100-2945-441/13. Fischer G y Miranda D. (2012). Uchuva (Physalis peruviana). In: Fischer G. (Ed). Manual para el cultivo de frutales en el trópico. Bogotá: Produmedios. Pp: 851-873. Galindo J y Pardo L. (2010). Uchuva (Physalis peruviana L.): Producción y manejo postcosecha. Bogotá: Corredor tecnológico agroindustrial, Cámara de Comercio. Pp: 116. Gastelum D. (2012). Demanda nutrimental y manejo agronómico de Physalis peruviana L. Tesis. Institución de enseñanza e investigación en ciencias agrícolas. Texcoco. Guney I and Guldur M. (2018). Inoculation techniques for assessing pathogenicity of Rhizoctonia solani, Macrophomina phaseolijna, Fusarium oxysporum and Fusarium solani on pepper seedling. Turk. J. Agric. Res. 5(1): 1-8. 14 Jiménez-Fernández D, Montes-Borrego M, Navas-Cortés J, Jiménez-Diaz R and Landa B. (2010). Identification and quantification of Fusarium oxysporum in planta and soil by means o fan improved specific and quantitative PCR assay. Applied Soil Ecology. 46: 372-382. Khilare V and Ahmed R. (2012). Effect of different media, pH and temperature on the growth of Fusarium oxysporum sp cicero causing chickepea wilt. Biomedical Research 2(1): 99-102, Maitlo S, Syed M, Rustamani R, Khuhro R and Lodhi A. (2016). Influence of inoculation methods and inoculum level on the agressiveness of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris on chickpea and plant growth. International Journal of Agriculture and Biology. 18(1): 31-36. McGoven. (2015). Mangenment of tomato diseases caused by Fusarium oxysporum. Crop. Prot 73: 78-92. Moreno C, Kloepper J, Ongena M, Cotes A. (2014). Biotic factors involved in biological control activity of Bacillus amyloliquefaciens (Bs006) against Fusarium oxysporum in Cape gooseberry (Physalis peruviana). IOBC-WPRS Bull. 2014; In Press. Nelson P. (1981). Life cycle and epidemiology of F. oxysporum. In: Mace M, Bell A and Beckman C. (Eds). Fungal wilt diseases of plants. Academic Press. New York. Pp: 51-80. Novoa R y Villagrán N. (2002). Evaluación de un instrumento medidor de clorofila en la determinación de niveles de nitrógeno foliar en maíz. Agi.Tec. 62(1). Ortiz H, León J, Rivero R y Hoyos – Carvajal L. (2011). Manual de prácticas de fitopatología general. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá: Produmedios. Pp: 16. Osorio-Guarin J, Enciso-Rodríguez F, González C, Fernández-Pozo N, Mueller L and Barrero L. (2016). Association analysis for disease resistance to Fusarium oxysporum in cape gooseberry (Physalis peruviana L.). BMC Genomics. 17: 248. Pinto M, Ranilla L, Apostolidis E, Lajolo F, Genovese M et al., (2009). Evaluation of antihyperglycemia and antihypertension potential of native Peruvians fruits using in vitro models. J. Med. Food 12: 278-291. Popenoe H, King S, León J, Kalinowski L. (1990). Goldenberry (cape gooseberry). In: Council N. Lost crops of the Incas: Little – know plants of the Andes with promise for worldwide cultivation. Washington D.C. National Academy Press. Pp: 241-252. Purwati R, Hidayah N and Sudarsono S. (2008). Inoculation methods and conidial densities of Fusarium oxysporum fsp cubense in abaca. Hayati Journal of Biosciences. 15(1):1-7. Rodriguez – Amézquita J, Velandia A and Viteri-Rosero S. (2010). Evaluación de microorganismos aislados de gallinaza por su potencial para el biocontrol de Fusarium oxysporum 15 en plantas de uchuva (Physalis peruviana). Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín. 63(2): 5499-5509. Yadav S, Ahir R, Yadav A and Meena, S. (2017). Inoculation techniques of Fusarium oxysporum on onion. Chemical Science Review and Letters. 6(22): 1059 – 1062. Shaner G, Finney RE. (1977). The effect of nitrogen fertilization on the expression of slowmildewing resistance in knox wheat. Phytopathology. 1977;67:1051–6. Sinegani A and Hosseinpur A. (2010). Evaluation of effect of different sterilization methods on soil biomass phosphorous extracted with NaHCO3. Plant Soil Enviorment. 56 (4): 156-162. Wellmann F.L. (1939). A technique for studying host resistance and pathogenicity in tomato Fusarium wilt. Phytopathology 29: 945-956. 16